抗菌肽CRAMP的安全性、稳定性及其在清除铜绿假单胞菌生物被膜中的作用

作者:李会; 熊静; 梅翠; 王士源; 周洋; 李晓芬; 付贵花; 张阳; 程鹏; 何玉张; 陈红伟
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目的是调查抗菌肽CRAMP的安全性和稳定性及其在去除铜绿假单胞菌生物膜方面的作用。利用兔血红细胞悬液的溶血和巨噬细胞(RAW264.7)小鼠腹腔的细胞毒性来研究CRAMP的安全性。研究了不同温度、蛋白酶、金属离子和酸碱梯度对CRAMP抗菌活性的影响。铜绿假单胞菌(PAO菌株1)的成熟生物膜构建在6孔细胞培养板上,以人抗菌肽LL-37和三种抗生素为对照,结晶紫染色法用于检测生物膜的数量,平板菌落计数法用于计数生物膜中的活菌数,苯酚-硫酸法与Folin-酚试剂相结合的方法检测生物膜的含量,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察了CRAMP干燥的PAO1号生物膜的形态变化。结果表明,在试验浓度下,CRAMP对兔红细胞的溶血率小于2%,在62.5~125mg·L-1时对RAW264.7无细胞毒性。温度(25~100),两个盐离子(Na+、K+)和pH为5~10。胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶都不同程度地影响了CRAMP的抗菌活性。在6孔细胞培养板中,MICCRAMP4次显著减少了pao1生物膜的数量(减少率为76.74%,P<0.01),并显著减少了生物膜中的活菌数量(1.2CFU-mL-1,P<0.01)。效果优于LL-37和三种抗生素。CRAMP组的胞外基质显著低于空白对照组和LL-37组(P<0.05)。CLSM的结果表明,与对照组相比,CRAMP组细菌的总荧光强度(PI+SYTO)显著低于空白对照组和LL-37组(P<0.05)。与空白对照组相比,CRAMP组和LL-37组死亡细菌的荧光强度比(PI/SYTO)显著升高(P<0.01)。总之,CRAMP具有低溶血性和低细胞毒性。除了不稳定的蛋白酶作用外,它们还具有良好的稳定性。对PAO1号成熟生物膜有明显的清除作用,效果优于LL-37。它们具有良好的药物开发前景。