苦荞愈伤遗传转化体系的优化及用于Ft CHS1的过表达分析
[目的]建立和优化苦荞愈伤组织遗传转化体系,为苦荞基因功能验证和分子育种提供研究工具。[方法]以苦荞品种西荞二号为材料,优化苦荞愈伤组织的遗传转化条件,包括苦荞外植体类型、愈伤组织诱导激素比例、继代培养基激素比例和农杆菌类型。通过苦荞类黄酮生物合成关键酶基因FtCHS1的过度表达,验证了优化的遗传转化系统。阳性菌株通过PCR筛选和荧光观察进行鉴定。花青素和黄酮醇支路代谢物的含量由紫外分光光度法和高效液相色谱法(high performance、liquid、HPLC)测定。相关基因的表达由实时荧光定量PCR分析类黄酮合成。比较FtCHS1过度表达和愈伤组织之间的差异与对照组进行了比较。[结果]苦荞诱导愈伤组织的最佳外植体为下胚轴。诱导培养基的最佳外植体为MS+0.8mgL-16-BA+3.5mg·l-12,4-d,诱导率为72%。继代培养基最好的外植体是MS+3mgL-16-BA+1mg·L-1、KT和愈伤组织的扩散率和扩散系数分别为98%和1.09。GV3101在转化过程中表现最好,转化效率为31.3%。ftchs1高表达愈伤组织的花青素、芦丁和杨梅素含量显著高于对照组(P<0.05),山奈酚和槲皮素的花青素、芦丁和杨梅素含量显著高于对照组(P<0.01)。外源FtCHS1的过度表达对转基因愈伤组织中五个内源同源基因和FtCHSs的表达水平没有影响(P>0.05),而FtCHI、FtF3H、LS1号、FtFLS2、FtF、LS3和FtDFR1的黄酮合成途径关键酶基因的表达上调(P<0.05)。此外,在FtMYB5和FtMYB6,特异性调节黄酮醇合成的转录因子基因上调,而花青素合成抑制剂基因FtMYB8的表达降低(P<0.05)。[结论]建立了苦荞愈伤组织遗传转化体系。过量表达FtCHS1的苦荞愈伤组织通过上调类黄酮合成相关基因的表达,增加了类黄酮物质的积累。