粉葛PtCHI基因的克隆、原核表达和亚细胞定位

作者:羽健宾; 郭丽君; 张静; 肖冬; 何龙飞; 王爱勤
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为了探索葛根品种间异黄酮代谢关键酶基因Pt·CHI的分子机制差异,初步揭示葛根品种间异黄酮含量差异的原因。本研究用乙醇提取葛根素和葛根总黄酮,并用高效液相色谱法测定其含量。在已报道的CHI葛根基因的基础上,采用同源克隆方法分离了野葛中的Pt-Chi基因,并对其进行了体外蛋白表达。同时,对拟南芥原生质体中Pt CHI基因的位置进行了研究。结果表明:(1)葛根的葛根素含量显著高于葛根,葛根总黄酮含量也高于葛根,但未达到显著水平。(2) 成功分离到野葛的PT-Chi基因,全长742bp和672bp完整ORF框架,编码223氨基酸,与野葛的CHI基因同源性为99%。(3) CHI基因在野葛中的表达为茎>根>叶,而CHI基因在野葛中的表达显著高于野葛。(4) 据预测,它是一种稳定的亲水性蛋白质,大小为27.8 KD,二级和三级结构主要为-螺旋,有25个磷酸化位点,与葛根、大豆和乌拉尔甘草密切相关。它更有可能与F3H2、F3H、4cl4、DFR2和CHS进行互动。(5) Pt·CHI(Aristole CHI)在体外成功诱导并分离出27.8个k D的单一蛋白质。(6) 通过拟南芥原生质体进一步揭示了PT-Chi主要位于叶绿体。本研究为进一步分析Pueraria枇杷和葛根中黄酮类成分的差异,以及PT chi的功能验证和异黄酮代谢途径机制的研究奠定了基础。